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探針設計的原則具體體現(xiàn)如下：
1. 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近探針。
2. 所選序列應該高度特異，盡量選擇具有最小二級結構的擴增片段——這是因為二級結構會影響反應效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進行二級結構檢測，如果不能避免二級結構，那么就要相應提高退火溫度。
3. 擴增長度應不超過400bp，理想的擴增長度在100-150bp內(nèi)，擴增片段越短，有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性。
4. 保持GC含量在20％和80％之間，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低，以及出現(xiàn)在熒光染料分析中非特異信號。
5. 為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G） 。
6. 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發(fā)卡結構的形成。
在原理上與引物設計是比較類似的。只是因為探針序列要求匹配度很高，所以對于探針的GC含量和Tm值都是有嚴格要求的，而且還要考慮到與上下游引物相匹配。假如你手頭已經(jīng)有了染料法的引物，然后想仍然使用這一對引物、在這一對引物對應的序列中間選一段作為探針可以嗎？我們不建議這么做。因為你單獨設計的上下游引物沒問題，單獨設計的探針看起來也沒問題，但把引物與探針放在一起，就有可能出現(xiàn)參數(shù)不兼容的問題。所以還是三者放在一起設計才好。
